Imobilizēto enzīmu jēdziens pirmo reizi parādījās 20. gadsimta otrajā pusē. Tikmēr 1916. gadā tika konstatēts, ka saharoze, kas sorbēta uz oglekli, saglabā savu katalītisko aktivitāti. 1953. gadā D. Šleits un N. Grubhofers veica pirmo pepsīna, amilāzes, karboksipeptidāzes un RNāzes saistīšanu ar nešķīstošu nesēju. Imobilizēto enzīmu jēdziens tika legalizēts 1971. gadā. Tas notika pirmajā inženierenzimoloģijas konferencē. Šobrīd imobilizēto enzīmu jēdziens tiek aplūkots plašākā nozīmē, nekā tas bija 20. gadsimta beigās. Apskatīsim šo kategoriju tuvāk.
Vispārīga informācija
Imobilizēti enzīmi ir savienojumi, kas ir mākslīgi saistīti ar nešķīstošu nesēju. Tomēr tie saglabā savas katalītiskās īpašības. Šobrīd šis process tiek aplūkots divos aspektos – proteīna molekulu kustības brīvības daļējas un pilnīgas ierobežošanas ietvaros.
Cieņa
Zinātnieki ir atklājuši noteiktas imobilizēto enzīmu priekšrocības. Darbojoties kā neviendabīgi katalizatori, tos var viegli atdalīt no reakcijas vides. Pētījuma ietvaros tika konstatēts, ka imobilizēto enzīmu lietošana var tikt atkārtota. Saistīšanas procesā savienojumi maina savas īpašības. Tie iegūst substrāta specifiku un stabilitāti. Tajā pašā laikā viņu darbība sāk būt atkarīga no vides apstākļiem. Imobilizētie fermenti ir izturīgi un tiem ir augsta stabilitātes pakāpe. Tas ir tūkstošiem, desmitiem tūkstošu reižu lielāks nekā, piemēram, brīvo enzīmu. Tas viss nodrošina tehnoloģiju, kurās ir imobilizēti fermenti, augstu efektivitāti, konkurētspēju un ekonomiju.
Mediji
J. Poratu identificēja ideālo materiālu galvenās īpašības, ko izmantot imobilizācijā. Uzrādītājiem jābūt:
- Nešķīstība.
- Augsta bioloģiskā un ķīmiskā izturība.
- Spēja ātri aktivizēties. Pārvadātājiem vajadzētu viegli reaģēt.
- Nozīmīga hidrofilitāte.
- Nepieciešamā caurlaidība. Tā indikatoram jābūt vienlīdz pieņemamam gan fermentiem, gan koenzīmiem, reakcijas produktiem un substrātiem.
Šobrīd nav neviena materiāla, kas pilnībā atbilstu šīm prasībām. Neskatoties uz to, praksē tiek izmantoti imobilizācijai piemēroti nesēji.noteiktas kategorijas fermenti īpašos apstākļos.
Klasifikācija
Materiāli, saistībā ar kuriem savienojumi tiek pārvērsti imobilizētos fermentos, atkarībā no to rakstura tiek iedalīti neorganiskajos un organiskajos. Daudzu savienojumu saistīšana tiek veikta ar polimēru nesējiem. Šie organiskie materiāli ir iedalīti 2 klasēs: sintētiskie un dabīgie. Katrā no tām savukārt tiek izdalītas grupas atkarībā no struktūras. Neorganiskos nesējus galvenokārt attēlo materiāli no stikla, keramikas, māla, silikagela un grafīta melnā. Strādājot ar materiāliem, populāras ir sausās ķīmijas metodes. Imobilizētos enzīmus iegūst, pārklājot nesējus ar titāna, alumīnija, cirkonija, hafnija oksīdu plēvi vai apstrādājot ar organiskiem polimēriem. Svarīga materiālu priekšrocība ir reģenerācijas vienkāršība.
Proteīna nesēji
Populārākie ir lipīdu, polisaharīdu un proteīnu materiāli. Starp pēdējiem ir vērts izcelt strukturālos polimērus. Tie galvenokārt ietver kolagēnu, fibrīnu, keratīnu un želatīnu. Šādas olb altumvielas ir plaši izplatītas dabiskajā vidē. Tās ir pieejamas un ekonomiskas. Turklāt tiem ir liels skaits funkcionālo grupu saistīšanai. Olb altumvielas ir bioloģiski noārdāmas. Tas ļauj paplašināt imobilizēto enzīmu izmantošanu medicīnā. Tikmēr olb altumvielām ir arī negatīvas īpašības. Imobilizētu enzīmu lietošanas trūkumi uz proteīnu nesējiem ir pēdējo augstā imunogenitāte, kā arīspēja reakcijās ieviest tikai noteiktas to grupas.
Polisaharīdi, aminosaharīdi
No šiem materiāliem visbiežāk izmanto hitīnu, dekstrānu, celulozi, agarozi un to atvasinājumus. Lai polisaharīdi būtu izturīgāki pret reakcijām, to lineārās ķēdes ir šķērssavienotas ar epihlorhidrīnu. Tīkla struktūrās tiek brīvi ievadītas dažādas jonogēnas grupas. Hitīns lielos daudzumos uzkrājas kā atkritumi garneļu un krabju rūpnieciskās pārstrādes laikā. Šī viela ir ķīmiski izturīga, un tai ir skaidri noteikta poraina struktūra.
Sintētiskie polimēri
Šī materiālu grupa ir ļoti daudzveidīga un pieejama. Tas ietver polimērus uz akrilskābes, stirola, polivinilspirta, poliuretāna un poliamīda polimēru bāzes. Lielākā daļa no tām ir mehāniski izturīgas. Pārveidošanas procesā tie nodrošina iespēju mainīt poru izmēru diezgan plašā diapazonā, ieviešot dažādas funkcionālās grupas.
Iesiešanas metodes
Šobrīd ir divas principiāli atšķirīgas imobilizācijas iespējas. Pirmais ir iegūt savienojumus bez kovalentām saitēm ar nesēju. Šī metode ir fiziska. Vēl viena iespēja ietver kovalentās saites rašanos ar materiālu. Šī ir ķīmiska metode.
Adsorbcija
Ar tās palīdzību tiek iegūti imobilizēti enzīmi, turot zāles uz nesēja virsmas sakarā ardispersijas, hidrofobās, elektrostatiskās mijiedarbības un ūdeņraža saites. Adsorbcija bija pirmais veids, kā ierobežot elementu mobilitāti. Tomēr arī tagad šī iespēja nav zaudējusi savu aktualitāti. Turklāt adsorbcija tiek uzskatīta par visizplatītāko imobilizācijas metodi nozarē.
Metodes iezīmes
Zinātniskās publikācijas apraksta vairāk nekā 70 fermentus, kas iegūti ar adsorbcijas metodi. Nesēji galvenokārt bija porains stikls, dažādi māli, polisaharīdi, alumīnija oksīdi, sintētiskie polimēri, titāns un citi metāli. Pēdējie tiek izmantoti visbiežāk. Zāļu adsorbcijas efektivitāti uz nesēja nosaka materiāla porainība un īpatnējais virsmas laukums.
Darbības mehānisms
Enzīmu adsorbcija uz nešķīstošiem materiāliem ir vienkārša. To panāk, saskaroties ar zāļu ūdens šķīdumu ar nesēju. Tas var pāriet statiskā vai dinamiskā veidā. Enzīmu šķīdumu sajauc ar svaigām nogulsnēm, piemēram, titāna hidroksīdu. Pēc tam savienojumu žāvē vieglos apstākļos. Enzīmu aktivitāte šādas imobilizācijas laikā tiek saglabāta gandrīz par 100%. Tajā pašā laikā īpašā koncentrācija sasniedz 64 mg uz gramu nesēja.
Negatīvi mirkļi
Adsorbcijas trūkumi ietver zemu stiprību, saistot fermentu un nesēju. Mainot reakcijas apstākļus, var novērot elementu zudumu, produktu piesārņojumu un olb altumvielu desorbciju. Lai uzlabotu spēkusaistošie nesēji ir iepriekš modificēti. Jo īpaši materiālus apstrādā ar metāla joniem, polimēriem, hidrofobiem savienojumiem un citiem polifunkcionāliem līdzekļiem. Dažos gadījumos pašas zāles tiek modificētas. Bet diezgan bieži tas noved pie tā aktivitātes samazināšanās.
Iekļaušana želejā
Šī opcija ir diezgan izplatīta tās unikalitātes un vienkāršības dēļ. Šī metode ir piemērota ne tikai atsevišķiem elementiem, bet arī vairāku enzīmu kompleksiem. Iekļaušanu želejā var veikt divos veidos. Pirmajā gadījumā zāles apvieno ar monomēra ūdens šķīdumu, pēc kura tiek veikta polimerizācija. Rezultātā parādās telpiskā gēla struktūra, kas satur enzīmu molekulas šūnās. Otrajā gadījumā zāles ievada gatavā polimēra šķīdumā. Pēc tam tas tiek ievietots želejveida stāvoklī.
Ielaušanās caurspīdīgās struktūrās
Šīs imobilizācijas metodes būtība ir ūdens enzīma šķīduma atdalīšana no substrāta. Šim nolūkam tiek izmantota daļēji caurlaidīga membrāna. Tas ļauj kofaktoru un substrātu zemas molekulmasas elementiem iziet cauri un aiztur lielas enzīmu molekulas.
Mikrokapsulācija
Ir vairākas iespējas iegulšanai caurspīdīgās struktūrās. No tiem vislielāko interesi rada mikrokapsulēšana un proteīnu iekļaušana liposomās. Pirmo variantu 1964. gadā piedāvāja T. Čans. Tas sastāv no tā, ka fermentu šķīdums tiek ievadīts slēgtā kapsulā, kuras sienas ir izgatavotas no daļēji caurlaidīgas.polimērs. Membrānas parādīšanos uz virsmas izraisa savienojumu saskarnes polikondensācijas reakcija. Viens no tiem ir izšķīdināts organiskajā, bet otrs - ūdens fāzē. Piemērs ir mikrokapsulas veidošanās, kas iegūta, polikondensējot sebacīnskābes halogenīdu (organiskā fāze) un heksametilēndiamīnu-1, 6 (attiecīgi ūdens fāze). Membrānas biezumu aprēķina mikrometra simtdaļās. Kapsulu izmērs ir simtiem vai desmitiem mikrometru.
Iekļaušana liposomās
Šī imobilizācijas metode ir tuva mikrokapsulēšanai. Liposomas ir izvietotas lipīdu divslāņu lamelārās vai sfēriskās sistēmās. Šo metodi pirmo reizi izmantoja 1970. gadā. Lai izolētu liposomas no lipīdu šķīduma, organiskais šķīdinātājs tiek iztvaicēts. Atlikušo plānā kārtiņu izkliedē ūdens šķīdumā, kurā atrodas ferments. Šī procesa laikā notiek lipīdu divslāņu struktūru pašsavienošanās. Šādi imobilizēti fermenti ir diezgan populāri medicīnā. Tas ir saistīts ar faktu, ka lielākā daļa molekulu ir lokalizētas bioloģisko membrānu lipīdu matricā. Liposomās iekļautie imobilizētie enzīmi ir nozīmīgākais pētnieciskais materiāls medicīnā, kas ļauj pētīt un aprakstīt dzīvības procesu modeļus.
Jaunu obligāciju veidošana
Imobilizācija, veidojot jaunas kovalentās ķēdes starp enzīmiem un nesējiem, tiek uzskatīta par visizplatītāko metodi rūpniecisko biokatalizatoru iegūšanai.galamērķis. Atšķirībā no fizikālajām metodēm šī iespēja nodrošina neatgriezenisku un spēcīgu saikni starp molekulu un materiālu. Tās veidošanos bieži pavada zāļu stabilizācija. Tajā pašā laikā fermenta atrašanās 1. kovalentās saites attālumā attiecībā pret nesēju rada zināmas grūtības katalītiskā procesa īstenošanā. Molekula tiek atdalīta no materiāla ar ieliktņa palīdzību. To bieži izmanto kā poli- un bifunkcionālus līdzekļus. Jo īpaši tie ir hidrazīns, ciānbromīds, glutāra dialhedrīds, sulfurilhlorīds utt. Piemēram, lai noņemtu galaktoziltransferāzi, starp nesēju un fermentu tiek ievietota šāda secība -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. Šādā situācijā struktūrā atrodas ieliktnis, molekula un nesējs. Tās visas ir savienotas ar kovalentām saitēm. Būtiska nozīme ir nepieciešamībai reakcijā ieviest funkcionālās grupas, kas nav būtiskas elementa katalītiskajai funkcijai. Tātad, kā likums, glikoproteīni tiek piesaistīti nesējam nevis caur proteīnu, bet gan caur ogļhidrātu daļu. Rezultātā tiek iegūti stabilāki un aktīvāki imobilizēti enzīmi.
Šūnas
Iepriekš aprakstītās metodes tiek uzskatītas par universālām visu veidu biokatalizatoriem. Tie cita starpā ietver šūnas, subcelulāras struktūras, kuru imobilizācija pēdējā laikā ir kļuvusi plaši izplatīta. Tas ir saistīts ar sekojošo. Kad šūnas ir imobilizētas, nav nepieciešams izolēt un attīrīt fermentu preparātus vai ieviest reakcijās kofaktorus. Tā rezultātā kļūst iespējamssistēmas, kas veic daudzpakāpju nepārtrauktus procesus.
Imobilizētu enzīmu izmantošana
Veterinārmedicīnā, rūpniecībā un citās tautsaimniecības nozarēs ar iepriekšminētajām metodēm iegūtās zāles ir diezgan populāras. Praksē izstrādātās pieejas sniedz risinājumu mērķtiecīgas zāļu ievadīšanas organismā problēmām. Imobilizēti enzīmi ļāva iegūt zāles ar ilgstošu iedarbību ar minimālu alergēniskumu un toksicitāti. Pašlaik zinātnieki risina problēmas, kas saistītas ar masas un enerģijas biokonversiju, izmantojot mikrobioloģiskas pieejas. Tikmēr būtisku ieguldījumu darbā sniedz arī imobilizēto enzīmu tehnoloģija. Šķiet, ka attīstības perspektīvas ir diezgan plašas. Tātad nākotnē vienai no galvenajām lomām vides stāvokļa monitoringa procesā būtu jāpiešķir jauniem analīzes veidiem. Jo īpaši mēs runājam par bioluminiscences un enzīmu imūnanalīzes metodēm. Uzlabotas pieejas ir īpaši svarīgas lignocelulozes izejvielu apstrādē. Imobilizētus enzīmus var izmantot kā vāju signālu pastiprinātājus. Aktīvais centrs var būt ultraskaņas, mehāniskas slodzes vai fitoķīmisko pārveidojumu pakļautībā esoša nesēja ietekmē.
