Gaismas absorbcija un turpmāka atkārtota emisija ar neorganiskām un organiskām vidēm ir fosforescences vai fluorescences rezultāts. Atšķirība starp parādībām ir intervāla garums starp gaismas absorbciju un plūsmas emisiju. Izmantojot fluorescenci, šie procesi notiek gandrīz vienlaikus, bet ar fosforescenci – ar zināmu kavēšanos.
Vēstures fons
1852. gadā britu zinātnieks Stokss pirmo reizi aprakstīja fluorescenci. Viņš izdomāja jauno terminu eksperimentu rezultātā ar fluoršpatu, kas ultravioletā gaismā izstaro sarkanu gaismu. Stokss atzīmēja interesantu parādību. Viņš atklāja, ka dienasgaismas gaismas viļņa garums vienmēr ir garāks nekā ierosmes gaismas viļņa garums.
19. gadsimtā tika veikti daudzi eksperimenti, lai apstiprinātu hipotēzi. Viņi parādīja, ka dažādi paraugi fluorescē, pakļaujot tiem ultravioleto gaismu. Materiāli, cita starpā, bija kristāli, sveķi, minerāli, hlorofils,zāļu izejvielas, neorganiskie savienojumi, vitamīni, eļļas. Krāsvielu tieša izmantošana bioloģiskajā analīzē sākās tikai 1930. gadā
Fluorescences mikroskopijas apraksts
Daži 20. gadsimta pirmajā pusē pētījumos izmantotie materiāli bija ļoti specifiski. Pateicoties indikatoriem, kurus nevarēja sasniegt ar kontrastmetodēm, fluorescences mikroskopijas metode ir kļuvusi par nozīmīgu instrumentu gan biomedicīnas, gan bioloģiskajos pētījumos. Iegūtie rezultāti bija ne mazāk svarīgi materiālu zinātnei.
Kādas ir fluorescences mikroskopijas priekšrocības? Ar jaunu materiālu palīdzību kļuva iespējams izolēt ļoti specifiskas šūnas un submikroskopiskas sastāvdaļas. Fluorescējošais mikroskops ļauj noteikt atsevišķas molekulas. Dažādas krāsvielas ļauj vienlaikus identificēt vairākus elementus. Lai gan iekārtas telpisko izšķirtspēju ierobežo difrakcijas robeža, kas, savukārt, ir atkarīga no parauga specifiskajām īpašībām, arī molekulu noteikšana zem šī līmeņa ir pilnīgi iespējama. Dažādiem paraugiem pēc apstarošanas ir autofluorescence. Šo parādību plaši izmanto petroloģijā, botānikā un pusvadītāju rūpniecībā.
Funkcijas
Dzīvnieku audu vai patogēno mikroorganismu izpēti bieži sarežģī pārāk vāja vai ļoti spēcīga nespecifiskā autofluorescence. Tomēr vērtība iekšpētniecība iegūst materiālā tādu komponentu ievadīšanu, kas ierosināti noteiktā viļņa garumā un izstaro vajadzīgās intensitātes gaismas plūsmu. Fluorohromi darbojas kā krāsvielas, kas spēj pašatķerties pie struktūrām (neredzamām vai redzamām). Tajā pašā laikā tie izceļas ar augstu selektivitāti attiecībā uz mērķiem un kvantu ražu.
Fluorescences mikroskopija ir kļuvusi plaši izmantota līdz ar dabisko un sintētisko krāsvielu parādīšanos. Tiem bija specifiski emisijas un ierosmes intensitātes profili, un tie bija vērsti uz konkrētiem bioloģiskiem mērķiem.
Atsevišķu molekulu identifikācija
Bieži vien ideālos apstākļos var reģistrēt viena elementa mirdzumu. Lai to izdarītu, cita starpā ir jānodrošina pietiekami zems detektora troksnis un optiskais fons. Fluoresceīna molekula var izstarot līdz 300 000 fotonu pirms iznīcināšanas fotobalināšanas dēļ. Ar 20% savākšanas ātrumu un procesa efektivitāti tos var reģistrēt aptuveni 60 tūkstošu apmērā
Fluorescences mikroskopija, kuras pamatā ir lavīnu fotodiodes vai elektronu pavairošana, ļāva pētniekiem novērot atsevišķu molekulu uzvedību sekundes un dažos gadījumos minūtes.
Grūtības
Galvenā problēma ir optiskā fona trokšņu slāpēšana. Sakarā ar to, ka daudziem filtru un lēcu konstrukcijā izmantotajiem materiāliem ir zināma autofluorescence, zinātnieku centieni sākotnējos posmos bija vērsti uzkomponenti ar zemu fluorescenci. Tomēr turpmākie eksperimenti noveda pie jauniem secinājumiem. Jo īpaši ir konstatēts, ka fluorescences mikroskopija, kuras pamatā ir pilnīga iekšējā atstarošana, nodrošina zemu fona un augstu ierosmes gaismas atdevi.
Mehānisms
Fluorescences mikroskopijas principi, kas balstīti uz kopējo iekšējo atstarošanos, ir ātri dilstoša vai neizplatoša viļņa izmantošana. Tas rodas saskarnē starp datu nesējiem ar dažādiem refrakcijas rādītājiem. Šajā gadījumā gaismas stars iet caur prizmu. Tam ir augsts refrakcijas indekss.
Prizma atrodas blakus ūdens šķīdumam vai zemu parametru stiklam. Ja gaismas stars ir vērsts uz to leņķī, kas ir lielāks par kritisko, stars pilnībā atstarojas no saskarnes. Šī parādība savukārt izraisa neizplatošu vilni. Citiem vārdiem sakot, tiek ģenerēts elektromagnētiskais lauks, kas iekļūst vidē ar zemāku laušanas koeficientu attālumā, kas ir mazāks par 200 nanometriem.
Neizplatošā viļņā gaismas intensitāte būs pilnīgi pietiekama, lai ierosinātu fluoroforus. Tomēr tā īpaši mazā dziļuma dēļ tā tilpums būs ļoti mazs. Rezultāts ir zema līmeņa fons.
Modifikācija
Fluorescences mikroskopiju, kuras pamatā ir pilnīga iekšējā atstarošanās, var realizēt ar epi-apgaismojumu. Tam nepieciešami objektīvi ar palielinātu skaitlisko diafragmu (vismaz 1,4, bet vēlams, lai tas sasniegtu 1,45-1,6), kā arī daļēji izgaismots aparāta lauks. Pēdējais tiek panākts ar nelielu plankumu. Lai nodrošinātu lielāku viendabīgumu, tiek izmantots plāns gredzens, caur kuru tiek bloķēta daļa plūsmas. Lai iegūtu kritisko leņķi, pēc kura notiek pilnīga atstarošana, ir nepieciešams augsts iegremdēšanas vides refrakcijas līmenis lēcās un mikroskopa vāka stiklā.
