Kas ir DNS hibridizācijas pamatā? Lai gan divpavedienu DNS secība parasti ir stabila fizioloģiskos apstākļos, mainot šos apstākļus laboratorijā (parasti paaugstinot apkārtējās vides temperatūru), molekulas sadalīsies atsevišķās virknēs. Pēdējie papildina viens otru, bet var arī papildināt citas sekvences, kas atrodas to vidē. Apkārtējās vides temperatūras pazemināšana ļauj vienpavediena molekulām atkvēlināties vai "hibridizēties" viena ar otru. Šī ir DNS hibridizācijas metode.
Jēdziens no molekulārās bioloģijas viedokļa
Zinātnieki, kas iesaistīti gan DNS replikācijā, gan DNS transkripcijā RNS, paļaujas uz nukleotīdu krustošanos un molekulārās bioloģijas metodēm. Tas ietver Southern un Northern blot, polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) un lielāko daļu DNS-RNS hibridizācijas un sekvencēšanas pieeju.
Pieteikums
Hibridizācija ir galvenā nukleotīda īpašībasekvences un tiek izmantota daudzās molekulārās bioloģijas metodēs. Divu sugu vispārējās ģenētiskās attiecības var noteikt, hibridizējot to DNS segmentus (DNS-DNS hibridizācija). Sakarā ar secību līdzību starp cieši saistītiem organismiem, lai izkausētu šādus DNS hibrīdus, ir nepieciešama augstāka temperatūra, salīdzinot ar attālākiem organismiem. Dažādas metodes izmanto hibridizāciju, lai noteiktu DNS parauga izcelsmi, tostarp polimerāzes ķēdes reakciju (PCR). Citā metodē īsās DNS sekvences tiek hibridizētas ar šūnu mRNS, lai identificētu ekspresētos gēnus. Farmācijas uzņēmumi pēta antisensu RNS izmantošanu, lai saistīties ar nevēlamu mRNS, neļaujot ribosomai pārvērst mRNS proteīnā.
DNS-DNS hibridizācija parasti attiecas uz molekulārās bioloģijas paņēmienu, kas mēra ģenētiskās līdzības pakāpi starp DNS sekvenču kopumiem. To parasti izmanto, lai noteiktu ģenētisko attālumu starp diviem organismiem. Tas ir plaši izmantots filoģenēzē un taksonomijā.
Metodika
Viena organisma DNS tika iezīmēta, pēc tam sajaukta ar nemarķētu DNS, ko varētu salīdzināt ar to. Maisījumu inkubē, lai ļautu DNS virknēm atdalīties, un pēc tam atdzesē, veidojot reģenerētu hibrīdu divpavedienu DNS. Hibridizētas sekvences ar augstu līdzības pakāpi saistās ciešāk un prasa vairāk enerģijas, lai tās atdalītu: t.i., tās atdalās, karsējot augstākā temperatūrā.temperatūra nekā atšķirīgas sekvences, process, kas pazīstams kā "DNS kušana".
DNS kūst
Novērtējot hibridizētās DNS kušanas profilu, divpavedienu DNS tiek piesaistīta tā sauktajai "kolonnai" un iegūtais maisījums tiek uzkarsēts. Katrā posmā kolonna tiek mazgāta, un DNS sekvences, kas kūst, kļūst vienpavediena un noskalojas no kolonnas. Temperatūra, kurā marķētā DNS iziet no kolonnas, atspoguļo secību līdzību (un pašlocīšanas modelis kalpo kā kontrole). Šie rezultāti tiek apvienoti, lai noteiktu ģenētiskās līdzības pakāpi starp organismiem. Saskaņā ar mūsdienu mikrobioloģiju DNS hibridizācija nav iespējama, neizprotot šīs lietas.
Kad šādā veidā tiek salīdzinātas vairākas ribonukleīnskābes (vai dezoksiribonukleīnskābes) sugas, līdzības vērtības ļauj sugu ievietot filoģenētiskajā kokā. Tāpēc šī ir viena no iespējamām pieejām molekulārās sistemātikas veikšanai. Šā paņēmiena pionieri Čārlzs Siblijs un Džons Ahlkvists izmantoja DNS-DNS hibridizāciju, lai pētītu putnu (Sibley-Ahlquist taksonomija) un primātu filoģenētiskās attiecības.
Bioloģijas nozīme
DNS-DNS hibridizācija ir zelta standarts baktēriju sugu atšķiršanai, ar līdzības vērtību vairāk nekā 70%, kas norāda, ka salīdzinātie celmi pieder pie dažādām sugām. 2014. gadā tika ierosināts 79% līdzības slieksnis baktēriju pasugas atdalīšanai.
Kritiķi apgalvo, ka metode ir neprecīza, lai salīdzinātu cieši radniecīgas sugas, jo jebkurš mēģinājums izmērīt atšķirības starp ortoloģiskajām sekvencēm starp organismiem ir pārņemts ar paralogu ekvivalentu hibridizāciju organisma genomā. DNS sekvencēšana un skaitļošanas secību salīdzināšana pašlaik ir plaši izmantotā metode ģenētiskā attāluma noteikšanai, lai gan šī pieeja joprojām tiek izmantota mikrobioloģijā, lai palīdzētu identificēt baktērijas.
Pašreizējais veids ir veikt DNS-DNS hibridizāciju silikonā, izmantojot pilnībā vai daļēji sekvencētus genomus. DSMZ izstrādātais GGDC ir visprecīzākais zināmais rīks DDH līdzīgu vērtību aprēķināšanai. Papildus citiem algoritmiskiem uzlabojumiem tas atrisina problēmu ar paralogām sekvencēm, rūpīgi filtrējot tās no atbilstības starp divām genoma sekvencēm.
ZIVIS metode
Fluorescences in situ hibridizācija (FISH) ir laboratorijas metode, ko izmanto DNS noteikšanai un sekvencēšanai, bieži vien konkrētā hromosomā.
1969. gadā Džozefs Gals un Mērija Lū Pardu publicēja rakstu, kurā tika parādīts, ka ribosomu DNS sekvences radioaktīvās kopijas var izmantot, lai noteiktu komplementāras DNS sekvences vardes olas kodolā. Kopš šiem sākotnējiem novērojumiem daudzi uzlabojumi ir palielinājuši daudzpusību unprocedūras jutīgums tādā mērā, ka in situ hibridizācija ("vietā", latīņu val.) tagad tiek uzskatīta par svarīgu instrumentu citoģenētikā. (Termins in situ tagad tiek lietots arī karcinomas augšanas sākuma stadijai, kad patoloģiskajā procesā ir iesaistīti tikai epitēlija audi.)
Fluorescējošās hibridizācijas secība
RNS zondes var būt izstrādātas jebkuram gēnam vai jebkurai secībai gēnā, lai vizualizētu lncRNS un miRNS mRNS audos un šūnās. FISH izmanto, pētot šūnu reprodukcijas ciklu, jo īpaši kodola starpfāzi jebkādām hromosomu anomālijām. FISH ļauj analizēt lielu skaitu arhīvu lietu, ir daudz vieglāk identificēt identificēto hromosomu, izveidojot zondi ar mākslīgu hromosomu bāzi, kas piesaistīs līdzīgas hromosomas.
Hibridizācijas signāli katrai zondei, kad tiek konstatēta kodola anomālija: katra mRNS un lncRNS noteikšanas zonde sastāv no 20 oligonukleotīdu pāriem, katrs pāris aptver 40–50 bp lielu telpu. lpp. Zondes izmanto patentētu ķīmiju, lai noteiktu mRNS.
Hibridizācija ar DNS zondēm
Zondes bieži izgatavo no DNS fragmentiem, kas ir izolēti, attīrīti un pastiprināti izmantošanai cilvēka genoma projektēšanā. Cilvēka genoma izmērs ir tik liels, salīdzinot ar garumu, ko var tieši sekvencēt, ka ir nepieciešams to sadalītfragmenti. Galu galā šie fragmenti tika sakārtoti, sadalot katra fragmenta kopiju vēl mazākās vienībās, izmantojot secībai specifiskas endonukleāzes, lai izmērītu katra mazā fragmenta izmēru, izmantojot izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju, izmantojot šo informāciju, lai noteiktu, kur lielie fragmenti pārklājas viens ar otru.
Lai saglabātu elementus ar to individuālajām DNS sekvencēm, fragmenti tika pievienoti pastāvīgi atkārtotu baktēriju populāciju sistēmai. Baktēriju klonālās populācijas, katrai populācijai saglabājot vienu mākslīgo hromosomu, tiek glabātas dažādās laboratorijās visā pasaulē. Mākslīgās hromosomas (BAC) var audzēt, ekstrahēt un marķēt jebkurā laboratorijā, kurā ir bibliotēka. Genoma bibliotēkas bieži tiek nosauktas to iestāžu vārdā, kurās tās tika izveidotas. Piemērs ir RPCI-11 bibliotēka, kas nosaukta Rosvelas vēža institūta vārdā Bufalo (Ņujorka, ASV). Šie fragmenti veido aptuveni 100 tūkstošus bāzes pāru un ir pamatā lielākajai daļai FISH zonžu.
