Ir daudz dažādu metožu dažādu savienojumu un vielu maisījumu sastāva analīzei un īpašību izpētei. Viena no šādām metodēm ir hromatogrāfija. Autorība metodes izgudrošanā un pielietošanā pieder krievu botāniķim M. S. Cvetam, kurš 20.gadsimta sākumā veica augu pigmentu atdalīšanu.
Metodes definīcija un pamati
Hromatogrāfija ir fizikāli ķīmiska metode maisījumu atdalīšanai un to sastāvdaļu noteikšanai, pamatojoties uz vielu, kas veido maisījumu (paraugu), sadalījumu starp kustīgo un stacionāro fāzi. Stacionārā fāze ir poraina cieta viela - sorbents. Tā var būt arī šķidra plēve, kas nogulsnēta uz cietas virsmas. Kustīgajai fāzei - eluentam - jāpārvietojas pa stacionāro fāzi vai jāplūst caur to, filtrējot ar sorbentu.
Hromatogrāfijas būtība ir tāda, ka dažādām maisījuma sastāvdaļām noteikti ir raksturīgas dažādas īpašības, piemēram, molekulmasa, šķīdība, adsorbējamība utt. Tāpēc kustīgās fāzes komponentu - sorbātu - mijiedarbības ātrums ar stacionāronav tas pats. Tas rada atšķirību maisījuma molekulu ātrumos attiecībā pret stacionāro fāzi, kā rezultātā komponenti tiek atdalīti un koncentrēti dažādās sorbenta zonās. Daži no tiem atstāj sorbentu kopā ar kustīgo fāzi - tās ir tā sauktās nesaturētās sastāvdaļas.
Īpaša hromatogrāfijas priekšrocība ir tā, ka tā ļauj ātri atdalīt sarežģītus vielu maisījumus, tostarp tos, kuriem ir līdzīgas īpašības.
Hromatogrāfijas veidu klasificēšanas metodes
Analīzē izmantotās metodes var klasificēt pēc dažādiem kritērijiem. Galvenā šādu kritēriju kopa ir šāda:
- stacionāro un kustīgo fāžu kopējais stāvoklis;
- sorbenta un sorbātu mijiedarbības fizikālais un ķīmiskais raksturs;
- kā ievadīt eluentu un to pārvietot;
- stacionārās fāzes izvietošanas metode, t.i., hromatogrāfijas tehnika;
- hromatogrāfijas mērķi.
Turklāt metodes var balstīties uz atšķirīgo sorbcijas procesa būtību, uz hromatogrāfiskās atdalīšanas tehniskajiem nosacījumiem (piemēram, zems vai augsts spiediens).
Sīkāk apskatīsim iepriekš minētos galvenos kritērijus un ar tiem saistītos visplašāk izmantotos hromatogrāfijas veidus.
Eluenta un sorbenta agregācijas stāvoklis
Pamatojoties uz to, hromatogrāfiju iedala šķidrumā un gāzē. Metožu nosaukumi atspoguļo mobilās fāzes stāvokli.
Izmantotā metode ir šķidruma hromatogrāfijalielmolekulāro savienojumu, tai skaitā bioloģiski svarīgu, maisījumu atdalīšanas procesos. Atkarībā no sorbenta agregācijas stāvokļa to iedala šķidrā-šķidrā un šķidrā-cietā fāzē.
Gāzu hromatogrāfijai ir šādi veidi:
- Gāzes adsorbcija (gāzes cietā fāze), kurā izmanto cietu sorbentu, piemēram, ogles, silikagelu, ceolītus vai porainus polimērus. Inerta gāze (argons, hēlijs), slāpeklis, oglekļa dioksīds darbojas kā eluents - atdalāmā maisījuma nesējs. Maisījuma gaistošo komponentu atdalīšana tiek veikta to dažādās adsorbcijas pakāpes dēļ.
- Gāze-šķidrums. Stacionārā fāze šajā gadījumā sastāv no šķidras plēves, kas nogulsnēta uz cietas inertas bāzes. Parauga sastāvdaļas tiek atdalītas atkarībā no to adsorbcijas vai šķīdības.
Gāzu hromatogrāfiju plaši izmanto organisko savienojumu maisījumu analīzei (izmantojot to sadalīšanās produktus vai atvasinājumus gāzveida formā).
Mijiedarbība starp sorbentu un sorbātiem
Saskaņā ar šo kritēriju izšķir šādus veidus:
- Adsorbcijas hromatogrāfija, ar kuras palīdzību maisījumi tiek atdalīti, jo atšķiras vielu adsorbcijas pakāpe ar nekustīgu sorbentu.
- Izplatīšana. Ar tās palīdzību atdalīšana tiek veikta, pamatojoties uz maisījuma sastāvdaļu atšķirīgu šķīdību. Izšķīšana notiek vai nu kustīgajā un stacionārajā fāzē (šķidruma hromatogrāfijā), vai tikai stacionārajā fāzē (gāzes šķidrumāhromatogrāfija).
- Nogulumieži. Šī hromatogrāfijas metode ir balstīta uz atdalāmo vielu veidojošo nogulšņu atšķirīgo šķīdību.
- Izslēgšana vai gēla hromatogrāfija. Tas ir balstīts uz molekulu izmēru atšķirībām, kuru dēļ atšķiras to spēja iekļūt sorbenta, tā sauktās gēla matricas, porās.
- Afīns. Šī specifiskā metode, kuras pamatā ir īpaša veida atdalītu piemaisījumu bioķīmiskā mijiedarbība ar ligandu, kas stacionārajā fāzē veido kompleksu savienojumu ar inertu nesēju. Šī metode ir efektīva proteīnu-enzīmu maisījumu atdalīšanai, un tā ir izplatīta bioķīmijā.
- Jonu apmaiņa. Kā parauga atdalīšanas koeficients šī metode izmanto atšķirību maisījuma komponentu spējā veikt jonu apmaiņu ar stacionāro fāzi (jonu apmaiņu). Procesa laikā stacionārās fāzes joni tiek aizstāti ar vielu joniem eluenta sastāvā, savukārt, ņemot vērā pēdējo atšķirīgo afinitāti pret jonu apmainītāju, rodas atšķirība to kustības ātrumā un līdz ar to maisījums tiek atdalīts. Stacionārajai fāzei visbiežāk tiek izmantoti jonu apmaiņas sveķi - speciāli sintētiskie polimēri.
Jonu apmaiņas hromatogrāfijai ir divas iespējas – attiecīgi anjonu (saglabā negatīvos jonus) un katjonu (attiecīgi saglabā pozitīvos jonus). Šo metodi izmanto ārkārtīgi plaši: elektrolītu, retzemju un transurāna elementu atdalīšanai, ūdens attīrīšanā, zāļu analīzē.
Tehnikas metožu atšķirības
Ir divi galvenie veidi, kā paraugs pārvietojas attiecībā pret stacionāro fāzi:
- Kolonnu hromatogrāfija atdalīšanas procesu veic speciālā aparātā - hromatogrāfijas kolonnā - mēģenē, kuras iekšējā dobumā tiek ievietots nekustīgs sorbents. Atbilstoši pildīšanas metodei kolonnas iedala divos veidos: iepakotas (tā sauktās "iepakotas") un kapilārās, kurās uz virsmas tiek uzklāts cieta sorbenta slānis vai stacionārās fāzes šķidra plēve. iekšējā siena. Iepakotajām kolonnām var būt dažādas formas: taisnas, U formas, spirālveida. Kapilāru kolonnas ir spirālveida.
- Planāra (plaknes) hromatogrāfija. Šajā gadījumā kā stacionārās fāzes nesēju var izmantot īpašu papīru vai plāksni (metālu, stiklu vai plastmasu), uz kuras tiek uzklāts plāns sorbenta slānis. Šajā gadījumā hromatogrāfijas metodi attiecīgi dēvē par papīra vai plānslāņa hromatogrāfiju.
Atšķirībā no kolonnu metodes, kur hromatogrāfijas kolonnas izmanto atkārtoti, plakanajā hromatogrāfijā jebkuru nesēju ar sorbenta slāni var izmantot tikai vienu reizi. Atdalīšanas process notiek, kad plāksne vai papīra loksne tiek iegremdēta traukā ar eluentu.
Eluenta ievadīšana un pārnešana
Šis faktors nosaka hromatogrāfisko zonu kustības raksturu gar sorbenta slāni, kas veidojas maisījuma atdalīšanas laikā. Ir šādas eluenta piegādes metodes:
- Priekšpuse. Šī metode ir visvienkāršākāizpildes tehnika. Kustīgā fāze ir tieši pats paraugs, kas tiek nepārtraukti ievadīts kolonnā, kas piepildīta ar sorbentu. Šajā gadījumā vismazāk saglabātā sastāvdaļa, kas adsorbēta sliktāk nekā citi, pārvietojas pa sorbentu ātrāk nekā pārējās. Rezultātā tikai šo pirmo komponentu var izolēt tīrā veidā, kam seko zonas, kas satur komponentu maisījumus. Izlases sadalījums izskatās šādi: A; A+B; A+B+C un tā tālāk. Tāpēc frontālā hromatogrāfija nav noderīga maisījumu atdalīšanai, taču tā ir efektīva dažādos attīrīšanas procesos, ar nosacījumu, ka izdalāmajai vielai ir zema aizture.
- Izspiešanas metode atšķiras ar to, ka pēc atdalāmā maisījuma ievadīšanas kolonnā tiek ievadīts eluents ar īpašu izspiestāju - vielu, kurai raksturīga lielāka sorbējamība nekā jebkurai no maisījuma sastāvdaļām. Tas izspiež visvairāk saglabāto komponentu, kas izspiež nākamo un tā tālāk. Paraugs pārvietojas pa kolonnu ar pārvietotāja ātrumu un veido blakus esošās koncentrācijas zonas. Izmantojot šāda veida hromatogrāfiju, katru komponentu var iegūt atsevišķi šķidrā veidā pie kolonnas izejas.
- Visizplatītākā ir eluenta (attīstīšanas) metode. Atšķirībā no pārvietošanas metodes, eluentam (nesējam) šajā gadījumā ir zemāka sorbspēja nekā parauga komponentiem. To nepārtraukti izlaiž caur sorbenta slāni, mazgājot to. Periodiski, pa daļām (impulsiem), atdalāmais maisījums tiek ievadīts eluenta plūsmā, pēc tam atkal tiek padots tīrs eluents. Izmazgājot (eluējot), komponenti tiek atdalīti,turklāt to koncentrācijas zonas ir atdalītas ar eluenta zonām.
Eluentu hromatogrāfija ļauj gandrīz pilnībā atdalīt analizēto vielu maisījumu, un maisījums var būt daudzkomponents. Šīs metodes priekšrocības ir arī komponentu izolācija viena no otras un maisījuma kvantitatīvās analīzes vienkāršība. Trūkumi ietver lielu eluenta patēriņu un zemu parauga komponentu koncentrāciju tajā pēc atdalīšanas pie kolonnas izejas. Eluenta metodi plaši izmanto gan gāzu, gan šķidrumu hromatogrāfijā.
Hromatogrāfiskie procesi atkarībā no mērķiem
Hromatogrāfijas mērķu atšķirība ļauj atšķirt tādas metodes kā analītiskā, preparatīvā un rūpnieciskā.
Ar analītisko hromatogrāfiju tiek veikta maisījumu kvalitatīvā un kvantitatīvā analīze. Analizējot parauga komponentus, izejot no hromatogrāfa kolonnas, tie nonāk detektorā - ierīcē, kas ir jutīga pret vielas koncentrācijas izmaiņām eluentā. Laiku, kas pagājis no brīža, kad paraugs ir ievietots kolonnā, līdz vielas maksimālajai koncentrācijai uz detektora, sauc par aiztures laiku. Ja kolonnas temperatūra un eluenta ātrums ir nemainīgs, šī vērtība ir nemainīga katrai vielai un kalpo par pamatu maisījuma kvalitatīvai analīzei. Kvantitatīvā analīze tiek veikta, mērot atsevišķu pīķu laukumu hromatogrammā. Parasti analītiskajā hromatogrāfijā izmanto eluenta metodi.
Preparatīvās hromatogrāfijas mērķis ir no maisījuma izolēt tīras vielas. Sagatavošanas kolonnām ir daudz lielākadiametrs nekā analītiskais.
Rūpniecisko hromatogrāfiju izmanto, pirmkārt, lai iegūtu lielu daudzumu tīru vielu, kas nepieciešamas konkrētai ražošanai. Otrkārt, tā ir svarīga mūsdienu tehnoloģisko procesu vadības un regulēšanas sistēmu sastāvdaļa.
Rūpnieciskajam hromatogrāfam ir vienas vai otras sastāvdaļas koncentrācijas skala un tas ir aprīkots ar sensoru, kā arī vadības un reģistrācijas sistēmām. Paraugi uz šādiem hromatogrāfiem tiek piegādāti automātiski ar noteiktu frekvenci.
Daudzfunkciju hromatogrāfijas aprīkojums
Mūsdienu hromatogrāfi ir sarežģītas augsto tehnoloģiju ierīces, ko var izmantot dažādās jomās un dažādiem mērķiem. Šīs ierīces ļauj analizēt sarežģītus daudzkomponentu maisījumus. Tie ir aprīkoti ar plašu detektoru klāstu: siltuma vadītspējas, optisko, jonizācijas, masas spektrometrisko un tā tālāk.
Turklāt mūsdienu hromatogrāfija izmanto automātiskās vadības sistēmas hromatogrammu analīzei un apstrādei. Vadību var veikt no datora vai tieši no ierīces.
Šādas ierīces piemērs ir daudzfunkcionālais gāzu hromatogrāfs "Crystal 5000". Tam ir četru maināmu detektoru komplekts, kolonnas termostats, elektroniskās spiediena un plūsmas kontroles sistēmas un gāzes vārstu vadības ierīces. Lai atrisinātu dažādas problēmas, ierīcei iriespēja uzstādīt gan iepakotas, gan kapilārās kolonnas.
Hromatogrāfs tiek vadīts, izmantojot pilnvērtīgu tastatūru un vadības displeju vai (citā modifikācijā) no personālā datora. Šo jaunās paaudzes ierīci var efektīvi izmantot ražošanā un dažādās pētniecības laboratorijās: medicīnas, tiesu medicīnas, vides.
Augstspiediena hromatogrāfija
Šķidruma kolonnas hromatogrāfijas veikšanai raksturīgs diezgan ilgs procesa ilgums. Lai paātrinātu šķidrā eluenta kustību, tiek izmantota kustīgās fāzes padeve kolonnā zem spiediena. Šo moderno un ļoti daudzsološo metodi sauc par augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) metodi.
HPLC šķidruma hromatogrāfa sūknēšanas sistēma nodrošina eluentu nemainīgā ātrumā. Izstrādātais ieplūdes spiediens var sasniegt 40 MPa. Datorvadība dod iespēju mainīt mobilās fāzes sastāvu atbilstoši noteiktai programmai (šo eluēšanas metodi sauc par gradientu).
HPLC var izmantot dažādas metodes, pamatojoties uz sorbenta un sorbāta mijiedarbības raksturu: sadali, adsorbciju, izmēru izslēgšanu, jonu apmaiņas hromatogrāfiju. Visizplatītākais HPLC veids ir apgrieztās fāzes metode, kuras pamatā ir polārās (ūdens) kustīgās fāzes un nepolāra sorbenta, piemēram, silikagēla, hidrofobā mijiedarbība.
Šo metodi plaši izmanto atdalīšanai, analīzei,negaistošu, termiski nestabilu vielu kvalitātes kontrole, kuras nevar pārvērst gāzveida stāvoklī. Tās ir agroķīmiskās vielas, zāles, pārtikas sastāvdaļas un citas sarežģītas vielas.
Hromatogrāfijas pētījumu nozīme
Dažādās jomās plaši tiek izmantoti dažādi hromatogrāfijas veidi:
- neorganiskā ķīmija;
- naftas ķīmija un kalnrūpniecība;
- bioķīmija;
- medicīna un farmācija;
- pārtikas rūpniecība;
- ekoloģija;
- kriminoloģija.
Šis saraksts ir nepilnīgs, bet atspoguļo to nozaru pārklājumu, kuras nevar iztikt bez hromatogrāfiskām analīzes, atdalīšanas un vielu attīrīšanas metodēm. Visās hromatogrāfijas pielietojuma jomās, sākot no zinātniskām laboratorijām līdz rūpnieciskai ražošanai, šo metožu nozīme vēl vairāk pieaug, jo tiek ieviestas modernas tehnoloģijas informācijas apstrādei, vadībai un sarežģītu procesu kontrolei.
