Baktēriju kultivēšana: metodes, principi, soļi un nosacījumi

2024 Autors: Angel Austin | [email protected]. Pēdējoreiz modificēts: 2023-12-17 05:35

Mikroorganismi dabā mums apkārt ir visur: augsnēs, ūdenstilpēs, uz dažādu objektu virsmām, ar tiem apdzīvo cilvēkus un dzīvniekus. Tas viss var kalpot par pārtikas, zāļu un ražošanas līniju mikrobu piesārņojuma avotiem. Baktēriju audzēšana ir nepieciešama, lai izpētītu to īpašības, vajadzības un īpašības. Tas savukārt ir nozīmīgs solis dažādu medikamentu izstrādē, slimību laboratoriskajā diagnostikā, ražošanas reaktoru aprēķināšanā un daudz ko citu.

Vispārīgi jēdzieni

Baktēriju kultivēšana mikrobioloģijā attiecas uz mikroorganismu kultivēšanu, ko veic laboratorijā. Savukārt mikrobus, kas izauguši uz izvēlētas barotnes, sauc par kultūru. Kultūras var sajaukt, ja tās veido dažāda veida mikroorganismi, un tīras, ja tās pārstāv tikai viena veida baktērijas.

Ja uzturaBarotnē tiek ievietota tikai viena šūna, un tās pavairošanas rezultātā tiek iegūta indivīdu grupa, tad šo mikroorganismu kopu sauc par klonu. Kad klons attīstās līdz vietai, kur tas kļūst redzams ar neapbruņotu aci, šo baktēriju kolekciju sauc par koloniju.

Parasti no dažādiem avotiem izolētu baktēriju kultivēšana tiek veikta atsevišķi viena no otras. Katru šādu atsevišķi audzētu mikrobu grupu sauc par celmu. Tātad, ja viens stafilokoku veids ir izolēts no trim avotiem (vai dažādām viena un tā paša produkta daļām, dažādiem cilvēkiem), viņi runā par trim šāda veida stafilokoku celmiem.

Baktēriju augšanas faktori

Tās ir dažādas aminoskābes, lipīdi, purīna bāzes un citi savienojumi, kas nepieciešami mikroorganismu attīstībai. Daži mikrobi var patstāvīgi ražot vajadzīgās vielas, savukārt citiem tās jāsaņem gatavā veidā. Atbilstoši mikroorganismu vajadzībām noteiktos augšanas faktoros tiek veikta baktēriju identificēšana un diferenciācija. Šis parametrs ir svarīgs arī pareizai barotnes sagatavošanai laboratorijas un biotehnoloģijas darbam:

• Aminoskābes. Baktērijām var būt nepieciešama viena noteikta aminoskābe vai skābju grupa. Tātad klostrīdijām nepieciešams leicīns un tirozīns, streptokokiem – leicīns un arginīns. Mikroorganismus, kuru augšanai nepieciešamas aminoskābes no ārpuses, sauc par auksotrofiem.
• Purīna un pirimidīna bāzes, kā arī to atvasinājumi (adenīns, guanīns un citi). Tie ir svarīgs faktors daudzu cilvēku izaugsmēStreptococcus sugas.
• Vitamīni. Tie ir daļa no baktērijām nepieciešamajiem koenzīmiem. Tātad nikotīnskābe, kā arī tās amīds, kas ir daļa no NAD un NADP, ir nepieciešama difterijai un šigellas korinebaktērijām. Tiamīns kā pirofosfāta neatņemama sastāvdaļa ir vajadzīgs Staphylococcus aureus, pneimokokiem, brucellām. Pantotēnskābe, kas ir daļa no CoA koenzīma, ir nepieciešama stingumkrampju baciļiem un noteiktiem streptokoku veidiem. Citohromi un līdz ar to folijskābe, hēmi un biotīns, kas tos veido, ir nepieciešami Mycobacterium tuberculosis un Haemophilus influenzae.

Vides prasības

Nosacījumi barotnei baktēriju kultivēšanai:

1. Uzturs. Tiem jābūt vielām, turklāt viegli sagremojamā veidā, kas nepieciešamas mikroorganismu barošanai un enerģijas atjaunošanai. Tie ietver organogēnus un minerālvielas. Dažiem mikroorganismiem papildus nepieciešami vitamīni un aminoskābes, ko tie nevar sintezēt.
2. Optimāls pH līmenis. Tas ietekmē šūnu membrānas caurlaidību un attiecīgi baktēriju spēju absorbēt barības vielas. Visbiežāk pH vērtībai jābūt 7, 2–7, 4 līmenī. Daudzi mikroorganismi savas dzīves laikā ražo produktus ar skābām vai sārmainām reakcijām, un, lai barības vides pH nemainītos, tam ir jābūt buferizētam.
3. Izotonisks. Osmotiskajam spiedienam barības vielu barotnē baktēriju audzēšanai jābūt tādām pašām vērtībām kāmikrobu šūnās. Tas parasti atbilst 0,5% NaCl šķīdumam.
4. Sterilitāte. Tas ir saistīts ar faktu, ka svešzemju baktēriju parādīšanās izkropļo analizētā celma pētījuma rezultātus.
5. Mitruma līmenis. Šim indikatoram, kā arī barotnes konsistencei, ir jābūt optimālām īpašībām konkrētam baktēriju veidam.
6. Redoksa potenciāls (RH2). Tas parāda vielu, kas nodod un pieņem elektronus, attiecību, kā arī barības vides skābekļa piesātinājuma līmeni. Aerobiem un anaerobiem baktēriju audzēšanas apstākļi šajā rādītājā nedaudz atšķiras. Anaerobie mikroorganismi vislabāk vairojas pie RH2 vērtībām zem 5 un aerobie mikroorganismi vismaz 10.
7. Vienveidība. Ir svarīgi, lai barotne satur nemainīgu daudzumu atsevišķu sastāvdaļu. Turklāt priekšroka tiek dota skaidriem risinājumiem, kas atvieglo ražas augšanas uzraudzību vai piesārņojuma pamanīšanu.

Kultūras barotņu veidi

Konkrētas barotnes izvēli mikroorganismu audzēšanai ietekmē daudzi faktori, tostarp to uztura īpašības un pētījuma mērķis. Galvenās iezīmes, kas ir pamatā uzturvielu barotņu klasifikācijai, ir šādas:

1. Sastāvdaļas. Saskaņā ar sākotnējām vielām, kas izmantotas substrāta izveidošanai, tās izšķir:

• dabīgi, kas gatavoti no dzīvnieku vai augu izcelsmes produktiem (piem., gaļa, piens, augļi) un ir piemēroti jauktu audzēšanailabība;
• pussintētisks, kurā dārgus dabiskos pārtikas produktus aizstāj ar nepārtikas produktiem (piemēram, kaulu miltiem, asins recekļiem) un kas ir optimāli noteiktu baktēriju veidu kultivēšanai vai to vielmaiņas produktu izolēšanai no vide;
• sintētiskie, kas ir sagatavoti no precīziem ķīmisko savienojumu daudzumiem, tiem ir zināms nemainīgs sastāvs un tie ir viegli reproducējami.

2. Konsistence (blīvums). Atšķiriet vidi:

• šķidrums;
• blīvs;
• pusšķidrs.

Pēdējos divus gatavo no īpašiem šķīdumiem vai šķidrām vielām, pievienojot agaru-agaru vai želatīnu, lai izveidotu vajadzīgo blīvumu. Turklāt blīva vide baktēriju augšanai ir sarecēts asins serums, kartupeļi, silikagela barotne, karagināns.

3. Savienojums. Pamatojoties uz to, vides ir:

• vienkāršs, kuru saraksts ir īss: gaļas peptona buljons (MBB), Hotingera buljons un agars, gaļas peptona agars (MPA), uzturvielu želatīns un peptona ūdens.
• komplekss, pagatavots no vienkāršām, pievienojot asinis, sūkalas, ogļhidrātus un citas vielas.

4. Pieraksts. Izšķir šādas uzturvielu barotnes:

• galvenās tiek izmantotas daudzu patogēnu mikrobu audzēšanai (parasti vienkāršs sastāvs);
• īpašus izmanto, lai izolētu un kultivētu baktērijas, kas neaug uz vienkāršiem substrātiem;
• selektīvie (tie ir arī selektīvi) ir piemēroti noteikta veida baktēriju izolēšanai un kavē saistīto mikrobu augšanu (selektivitāteradīts, barotnei pievienojot noteiktas vielas, piemēram, antibiotikas vai sāļus, vai regulējot pH);
• diferenciāldiagnostika ļauj atšķirt vienu baktēriju veidu no cita, novērtējot, piemēram, barotnes fermentatīvo aktivitāti;
• konservanti ir nepieciešami sākotnējai inokulācijai ar sekojošu paraugu transportēšanu, jo tie novērš mikroorganismu nāvi, kā arī kavē citu baktēriju augšanu.

Mediju sagatavošana

Svarīgākais solis anaerobo baktēriju audzēšanā ir piemērotas barotnes sagatavošana. Kad ir atlasīti optimālie parametri, pārejiet uz šādiem posmiem:

• svēršana, atlasot komponentu paraugus analītiskajos svaros;
• šķīdināšanu veic destilētā ūdenī, kas uzkarsēts līdz 70 °C, un fosfātus, mikrosāļus un makrosāļus izšķīdina atsevišķi;
• vāra ūdens peldē divas minūtes;
• pH noteikšana ar indikatorpapīru vai potenciometru;
• filtrēšana caur mitru audumu vai papīra filtriem šķidrai, kā arī izkausētai blīvai barotnei un caur kokvilnas marles filtru agara barotnei;
• pudeļu pildīšana veikta ar 3/4 jaudu;
• vidēji atkarīga sterilizācija;
• sterilitātes kontrole tiek veikta, divas dienas nostādot termostatā, kam seko apskate;
• ķīmiska kontrole, lai noteiktu pH līmeni un nepieciešamo saturupreces;
• bioloģiskā kontrole ar izmēģinājuma inokulāciju.

Stikla trauku un mediju sterilizācija

Viens no baktēriju audzēšanas pamatprincipiem ir sterilitāte. Svešu mikroorganismu augšana un attīstība var ietekmēt barības barotnes īpašības, mainot tās ķīmisko sastāvu un pH. Sterilizācija ir galvenais nosacījums tīrkultūru audzēšanai. Praksē šis termins nozīmē absolūti visu dzīvības formu iznīcināšanas metodes uz sterilizēto priekšmetu virsmas un tilpumā. Trauki, izmantotie instrumenti, barotnes un citi pētījuma laikā izmantotie priekšmeti tiek sterilizēti.

Daži sterilizācijas veidi:

• Aizdedze. Cilpu un adatu sterilizācija sēšanai, stikla priekšmetstikliņi, dažus instrumentus var veikt, izmantojot degli vai spirta lampu.
• Vāra. Piemērots darbam ar šļircēm, adatām, pārtiku, taču neiznīcina baktēriju sporas.
• Sausā karstuma sterilizācija. To veic īpašā žāvēšanas skapī un ir piemērota kolbu, mēģeņu un citu laboratorijas stikla trauku apstrādei.
• Sterilizācija ar tvaiku. Šī metode tiek veikta autoklāvā, un tā ir ļoti efektīva. Bet tas nav piemērots uzturvielu barotnēm, kas satur olb altumvielas vai citus savienojumus, kas sadalās augstā temperatūrā. Saudzējošāku var saukt par tindalizāciju. To veic Koha katlā un apvieno sporu dīgtspēju ar to iznīcināšanu.
• Pasterizācija. To lieto barotnēm, kuras vārot maina savas īpašības (piem., piens, vīns, alus), spējatbrīvot tos no mikroorganismiem, kas nenes sporas. Apstrādes temperatūra ir tikai 50-60 ° C piecpadsmit līdz trīsdesmit minūtes. Dažos gadījumos tiek izmantota aukstā sterilizācija, ko veic, izmantojot filtrus vai UV starus.

Baktēriju audzēšanas apstākļi

Baktēriju augšana un attīstība iespējama tikai pie noteiktiem faktoriem un katra no tiem vērtībām:

1. Temperatūra. Ir trīs baktēriju grupas, kas atšķiras pēc temperatūras izvēles:

• termofīli jeb siltumu mīlošie mikrobi aug 45-90°C temperatūrā, kas nozīmē, ka tie nevairojas cilvēku un dzīvnieku organismos;
• psihrofili jeb aukstumu mīlošie mikroorganismi dod priekšroku temperatūrai 5-15°C robežās un tiek audzēti saldētavās;
• mezofīli, attīstās 25-37 °C temperatūrā, tajos ietilpst lielākā daļa baktēriju.

2. Gaisma. Tā ir fototrofisko baktēriju audzēšanas iezīme, jo tās veic fotosintēzes procesu. Bet lielākajai daļai mikrobu apgaismojums nav priekšnoteikums. Un pat otrādi, saules ultravioletais starojums var kavēt to attīstību.

3. Ūdens. Visiem mikroorganismiem ir nepieciešams ūdens pieejamā (šķidrā) veidā. Tāpēc saldētai pārtikai ir maz vai vispār nevairojas baktērijas.

4. Vides skābums. Šis baktēriju kultivēšanas princips jau ir detalizēti apspriests iepriekš.

5. Aerācija. Skābeklis kā ķīmiskais elements ir neatņemama ūdens sastāvdaļa un ievērojams skaits savienojumu, ko izmantomikroorganismu audzēšana. Gāzveida skābekli var saturēt arī ūdens un citi šķidrumi izšķīdinātā veidā. Ievērojamai daļai baktēriju nepieciešama pastāvīga skābekļa molekulu piegāde. Bet vairākiem mikroorganismiem tas nav nepieciešams, vai, vēl ļaunāk, gāzveida skābeklis tiem ir toksisks, jo tiem nav katalāzes un peroksidāzes, kas iznīcina toksiskos elpceļu produktus. Tāpēc vissvarīgākais solis anaerobo baktēriju audzēšanā ir O₂ molekulu izvadīšana no barības vides.

6. Mikroorganismu audzēšana. Aerobo un anaerobo baktēriju audzēšana tiek veikta dažādos vides slāņos un dažādos režīmos.

Aerobo mikroorganismu audzēšana

Aerobo baktēriju audzēšanai nepieciešams molekulārais skābeklis. Lai iegūtu aerobu tīrkultūras, kuras var veiksmīgi izmantot medicīnā un pārtikas rūpniecībā, tiek izmantotas šādas metodes:

• virsmas augšana blīvā vidē vai šķidrā vidē (to plānā slānī), kad skābeklis nāk tieši no gaisa;
• dziļa kultivēšana šķidrā vidē, kad ar pastāvīgu aerāciju tiek panākts tajos izšķīdinātā skābekļa daudzuma palielinājums.

Anaerobo mikroorganismu audzēšana

Šā tipa baktēriju kultivēšanas pamatprincips ir to minimālais kontakts ar atmosfēras skābekli. Nodrošināt apstākļus to augšanai ir daudz grūtāk nekā aerobiem. Lai izolētu anaerobus no molekulārās O₂:

tiek izmantotas šādas metodes.

1. Fiziskā. Šī anaerobo baktēriju audzēšanas metode ir reducēta līdz to audzēšanai īpašā vakuuma aparātā - mikroanaerostatā. Gaiss tajā tiek aizstāts ar īpašu slāpekļa gāzu maisījumu, pievienojot 10% ūdeņraža un 5% oglekļa dioksīda.
2. Ķīmiskā. Tie ietver: absorbējošu vielu izmantošanu (piemēram, Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) vai reducējošās vielas (piemēram, askorbīnskābe).
3. Bioloģiskie. Tas ir saistīts ar aerobu un anaerobu kopīgu audzēšanu slēgtā sistēmā. Šī baktēriju kultivēšanas metode ietver vienu Petri trauciņa pusi ar dažām aerobām baktēriju sugām un otru pusi ar pētīto anaerobu. Tā attīstība sāksies brīdī, kad būs izlietots viss skābeklis.

Anaerobo baktēriju audzēšanai ir piemērotas šādas sēšanas metodes:

• virsmas slānī;
• virsmas slānī, kas piepildīts ar sterilu parafīnu;
• blīvas barotnes biezumā;
• dziļos viskozu materiālu slāņos.

Tīras kultūras iegūšana

Mikrobiologi parasti strādā ar paraugiem, kuros dzīvo daudz dažādu veidu mikrobi. Tomēr, lai noteiktu mikroorganismu (ģimenes, ģints, sugas) sistemātisko stāvokli, kā arī izpētītu to īpašības, ir nepieciešams tos izolēt un audzēt tīrkultūru. Tiem ir liela nozīme daudzās pārtikas nozarēs, piemēram, siera, maizes, kvasa, vīna u.c. Pienskābes baktēriju audzēšana ļauj iegūtbūtiska sastāvdaļa raudzētu piena produktu, mīklas, kakao, skābbarības un pat plastmasas ražošanā.

Tīrkultūras izdalīšanas metode blīvā barotnē ir balstīta uz mikroorganismu šūnu mehānisku atdalīšanu ar sekojošu izolētu kultivēšanu. Paraugu pārvieto sterilā ūdens vai fizioloģiskā šķīduma tilpumā (tilpums 10–100 ml) un pēc tam krata divas minūtes. Lai izdalītu mikroorganismus, kas atrodas pētāmā materiāla biezumā (piemēram, desas vai siers), vispirms tiek veikta parauga gabalu berzēšana ar steriliem instrumentiem ar smiltīm. Iepriekš sagatavoto materiālu, kas sver 1 g vai tilpumu 1 ml, atšķaida ar sterilu ūdeni 10, 100, 1000 utt. reizes. Tiek izvēlēta atšķaidīšanas pakāpe, kas nodrošina šūnu koncentrāciju, kas atbilst metodes iespējām.

Sekojošā mikroorganismu kultivēšana ir barības barotnes sagatavošana. Parasti tiek izvēlēta blīva barotne (MPA). Vispirms to izkausē un atdzesē līdz 45-50 °C, un tikai tad lej vairākos Petri trauciņos (trīs līdz piecos gabaliņos), uz kuru dibena liek dažādu koncentrāciju pārbaudāmās vielas tamponus. Tālāk tiek veikta vēl nesasaldētās barotnes un tajā ievadītā materiāla sajaukšana. Šādi šūnas tiek fiksētas dažādos substrāta tilpuma punktos.

Pēc tam Petri trauciņus ievieto termostatā uz 2 dienām 22 °C temperatūrā. Šajā laikā šūnas vairojas tiktāl, ka katras šūnas izveidotā kolonija kļūst redzama ar neapbruņotu aci. Katrs no tiem ir tāda veida baktēriju tīrkultūra, no kuras šūnām tā irroze.

Pēc tam no Petri trauciņiem mikroorganismi tiek subkultivēti atsevišķās mēģenēs, kas piepildītas ar barotni. Tādā veidā no jaukta parauga tiek izolētas tīrkultūras. Šī metode nes tās izstrādātāja vārdu - R. Koch. To mēdz dēvēt arī par kausa metodi jeb noplicinošo sēju. Pēc dažāda veida baktēriju tīrkultūru iegūšanas nosaka to formu, sporas un saimes.

Visi darbi jāveic saskaņā ar aseptikas principiem. Lai izvairītos no priekšlaicīgas mikroorganismu attīstības, pētījums jāveic tūlīt pēc paraugu ņemšanas. Krāna ūdens tiek analizēts pēc pirmo porciju iztukšošanas, jo tajās var būt caurulēs un krānos uzkrājušies mikrobi. Augļu, ogu un dārzeņu mikroflora galvenokārt atrodas uz virsmas (mizas), tāpēc no tās tiek veiktas mazgāšanas. Lai to izdarītu, ievietojiet augli sterilā traukā un piepildiet to ar nepieciešamo ūdens daudzumu. Pēc tam tos diezgan enerģiski sakrata un ūdeni lej citā traukā. Ražas no auduma izstrādājumiem iegūst arī tamponos, taču iepriekš no tiem tiek izgriezti noteikta izmēra gabaliņi.