Gram traipu plaši izmanto mikrobioloģijā, jo tas ir viens no vienkāršākajiem veidiem, kā atšķirt baktērijas, pamatojoties uz to šūnu sienas sastāvu. Saskaņā ar gramu visas baktērijas var iedalīt grampozitīvās (Gram (+)) un gramnegatīvās (Gram (-)). Grama traipu metode tika izstrādāta 1884. gadā un kopš tā laika nav zaudējusi savu popularitāti, lai gan tā ir vairākkārt modificēta.
Šūnu sienas struktūra
Gramkrāsošana atklāj, vai baktērija ir grampozitīva vai gramnegatīva. Baktēriju sadalīšana gramos (+) un gramos (-) tiek veikta saskaņā ar to šūnu sienas struktūru.
Šūnu siena satur vislielāko daudzumu peptidoglikāna (mureīna) - kompleksas vielas, kas ietver peptapeptīdu un glikānu. Glikāns sastāv no mainīgiem N-acetilglikozamīna un N-acetilmuramīnskābes atlikumiem, kas saistīti viens ar otru ar β-1,4-glikozīdiskās saites. Peptidoglikāns nodrošina šūnu formas uzturēšanu, osmotisko aizsardzību un antigēnas funkcijas.
Galvenās atšķirības starp grampozitīvām un gramnegatīvām baktērijām
Dažādām baktērijām ir atšķirīgs peptidoglikāna slāņa biezums. Baktērijās, kas ir klasificētas kā grampozitīvas, tas svārstās no 15 līdz 80 nm, savukārt gramnegatīvām tas ir no 2 līdz 8 nm. Tajā pašā laikā gramnegatīvajām baktērijām zem peptidoglikāna slāņa ir īpaša struktūra, kuras grampozitīvām baktērijām nav - periplazmatiskā telpa. Šī telpa ir piepildīta ar hidrolītiskiem enzīmiem - β-laktamāzi, ribonukleāzi 1, fosfatāzi. Tieši šie fermenti ir atbildīgi par gramnegatīvo baktēriju rezistenci pret daudzām antibiotikām.
Gram(-) peptidoglikāna baktēriju slānis ir saistīts ar lipopolisaharīdu, antigēnu struktūru, kas satur endotoksīnu. Gram(+) baktērijās teikoīnskābes pilda līdzīgas funkcijas.
Gramnegatīvajām baktērijām ir papildu struktūra – ārējā membrāna.
Krāsošanas metodes būtība
Pirms sākat krāsot, tiek sagatavoti pētīto baktēriju uztriepes. Lai to izdarītu, uz stikla priekšmetstikliņa pilina ūdeni un tur ar baktēriju cilpu pievieno mikroorganismu kultūru. Pēc tam, kad ūdens ir pilnībā izžuvis, uztriepes tiek fiksētas - stikla priekšmetstikliņu vairākas reizes pārnēsā virs degļa liesmas. Gramu krāsošana ir efektīvāka nekā krāsošana ar dzīvām baktērijām - krāsvielu molekulas labāk saistās ar atmirušajām šūnām.
Krāsošana notiek vairākos posmos:
- Nelielus filtrpapīra gabaliņus uzliek uz fiksētas uztriepes un ielej galveno krāsvielu - genciānas violeto vai metilēnzilo.
- Pēc 3-5 minūtēm noņemiet krāsaino filtrpapīru un uz 1 minūti piepildiet uztriepi ar Lugola šķīdumu. Šajā gadījumā preparāts kļūst tumšāks.
- Lugol šķīdumu notecina un uztriepi apstrādā ar tīru etilspirtu: dažus pilienus uzpilina uz preparāta, notecina pēc 20 sekundēm. Procedūru atkārto 2-3 reizes.
- Izskalojiet priekšmetstikliņu ar testa preparātu ar destilētu ūdeni.
- Izgatavojiet papildu krāsojumu - pabeidziet sagatavošanu ar fuksīnu. Pēc 1-2 minūtēm krāsviela tiek nomazgāta.
- Pēc ūdens izžūšanas pārbaudiet uztriepi mikroskopā. Grampozitīvās baktērijas būs zili violetas, gramnegatīvās baktērijas būs rozā vai sarkanas.
Atšķirīgu krāsojumu cēloņi
Kā aprakstīts iepriekš, baktēriju gramu iekrāsošana krāso grampozitīvās baktērijas zili violeti un gramnegatīvās baktērijas sarkanā vai rozā krāsā. Iemesls baktēriju atšķirīgai krāsošanai ar šo metodi ir tāds, ka pēc genciānas violetas šķīstošās formas nonākšanas šūnā krāsviela pāriet nešķīstošā joda formā. Apstrādājot baktērijas ar etilspirtu, šī nepolārā šķīdinātāja iedarbībā no membrānas tiek ekstrahēti lipīdi. Pēc tam membrāna kļūst poraina un vairs nav būtisks šķērslis krāsas izskalošanai. Tomērpeptidoglikāns ir izturīgāks pret nepolāriem šķīdinātājiem, tostarp spirtu. Tieši viņš neļauj krāsvielai izskaloties, tāpēc baktērijas ar biezu mureīna slāni kļūst zili violetas (grampozitīvas), un pēc apstrādes ar spirtu tās nemaina savu krāsu.
Gramnegatīvo baktēriju plāns mureīna slānis nespēj noturēt šūnā krāsvielu molekulas, tāpēc pēc spirta iedarbības tās kļūst bezkrāsainas - krāsojas gramnegatīvi.
Pēc fuksīna iedarbības ar gramiem iekrāsotās baktērijas paliek zili violetas, bet gramnegatīvās baktērijas kļūst rozā sarkanas.
Gram(+) un Gram(-) baktēriju piemēri
Gramnegatīvās baktērijas ietver cianobaktērijas, sēra baktērijas, dzelzs baktērijas, hlamīdijas, riketsijas, etiķskābes baktērijas, daudzas metilobaktērijas, tiona baktērijas, arsenitobaktērijas, karboksibaktērijas.
Bifdobaktērijas, daudzas ūdens baktērijas, streptokoki un stafilokoki ir grampozitīvi.
