Molekulārās bioloģiskās izpētes metodēm ir liela nozīme mūsdienu medicīnā, tiesu medicīnā un bioloģijā. Pateicoties DNS un RNS izpētes sasniegumiem, cilvēks spēj izpētīt organisma genomu, noteikt slimības izraisītāju, atpazīt vēlamo nukleīnskābi skābju maisījumā utt.
Molekulāri bioloģiskās izpētes metodes. Kas tas ir?
70. un 80. gados zinātniekiem pirmo reizi izdevās atšifrēt cilvēka genomu. Šis notikums deva impulsu gēnu inženierijas un molekulārās bioloģijas attīstībai. DNS un RNS īpašību izpēte ir novedusi pie tā, ka tagad ir iespējams izmantot šīs nukleīnskābes, lai diagnosticētu slimību, pētītu gēnus.
DNS un RNS iegūšana
Molekulārās bioloģiskās diagnostikas metodēm nepieciešama izejmateriāla klātbūtne: biežāk tās ir nukleīnskābes. Ir vairāki veidi, kā šīs vielas izolēt no dzīvo organismu šūnām. Katram no tiem ir savas priekšrocības un trūkumi, un tas ir nepieciešamsjāņem vērā, izvēloties metodi tīru nukleīnskābju izdalīšanai.
1. DNS iegūšana saskaņā ar Marmur. Metode sastāv no vielu maisījuma apstrādes ar spirtu, kā rezultātā izgulsnējas tīra DNS. Šīs metodes trūkums ir agresīvu vielu izmantošana: fenols un hloroforms.
2. DNS izolēšana saskaņā ar Boom. Galvenā šeit izmantotā viela ir guanidīna tiocianāts (GuSCN). Tas veicina dezoksiribonukleīnskābes nogulsnēšanos uz specializētiem substrātiem, no kuriem to pēc tam var savākt, izmantojot īpašu buferi. Tomēr GuSCN ir PTC inhibitors, un pat neliela tā daļa, kas nokļūst izgulsnētajā DNS, var ietekmēt polimerāzes ķēdes reakcijas gaitu, kam ir svarīga loma darbā ar nukleīnskābēm.
3. Piemaisījumu sedimentācija. Metode atšķiras no iepriekšējām ar to, ka tiek izgulsnētas nevis dezoksiribonukleīnskābes molekulas, bet gan piemaisījumi. Lai to izdarītu, tiek izmantoti jonu apmaiņi. Trūkums ir tāds, ka ne visas vielas var izgulsnēties.
4. Masu skrīnings. Šo metodi izmanto gadījumos, kad nav nepieciešama precīza informācija par DNS molekulas sastāvu, bet ir nepieciešams iegūt dažus statistikas datus. Tas izskaidrojams ar to, ka, apstrādājot ar mazgāšanas līdzekļiem, jo īpaši sārmiem, nukleīnskābes struktūra var tikt bojāta.
Pētīšanas metožu klasifikācija
Visas molekulāri bioloģiskās izpētes metodes ir iedalītas trīs lielās grupās:
1. Pastiprināšana (izmantojot daudzus fermentus). Šeitattiecas uz PCR – polimerāzes ķēdes reakciju, kam ir liela nozīme daudzās diagnostikas metodēs.
2. Nepastiprinošs. Šī metožu grupa ir tieši saistīta ar nukleīnskābju maisījumu darbību. Piemēri ir 3 bloti, in situ hibridizācija utt.
3. Metodes, kuru pamatā ir signāla atpazīšana no zondes molekulas, kas saistās ar konkrētu zondes DNS vai RNS. Piemērs ir hibrīda uztveršanas sistēma (hc2).
Fermenti, kurus var izmantot molekulārās bioloģijas pētījumu metodēs
Daudzas molekulārās diagnostikas metodes ietver plašu enzīmu klāstu. Tālāk ir norādītas visbiežāk izmantotās:
1. Restrikcijas enzīms - "sagriež" DNS molekulu vajadzīgajās daļās.
2. DNS polimerāze - sintezē divpavedienu dezoksiribonukleīnskābes molekulu.
3. Reversā transkriptāze (revertāze) - izmanto, lai sintezētu DNS uz RNS veidnes.
4. DNS ligāze – atbild par fosfodiestera saišu veidošanos starp nukleotīdiem.
5. Eksonukleāze - noņem nukleotīdus no dezoksiribonukleīnskābes molekulas gala sekcijām.
PCR ir galvenā DNS amplifikācijas metode
Polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) aktīvi izmanto mūsdienu molekulārajā bioloģijā. Šī ir metode, ar kuras palīdzību no vienas DNS molekulas var iegūt milzīgu skaitu kopiju (molekulas tiek pastiprinātas).
PCR galvenās funkcijas:
- diagnostikaslimības;
- DNS segmentu, gēnu klonēšana.
Lai veiktu polimerāzes ķēdes reakciju, ir nepieciešami šādi elementi: sākotnējā DNS molekula, termostabila DNS polimerāze (Taq vai Pfu), dezoksiribonukleotīdu fosfāti (slāpekļa bāzu avoti), primeri (2 praimeri uz 1 DNS molekulu) un pati bufersistēma, kurā ir iespējamas visas reakcijas.
PCR sastāv no trim posmiem: denaturācijas, primera atkausēšanas un pagarināšanas.
1. Denaturācija. Temperatūrā 94-95 grādi pēc Celsija ūdeņraža saites starp diviem DNS pavedieniem tiek pārrautas, un rezultātā mēs iegūstam divas vienpavedienu molekulas.
2. Grunts atkausēšana. Temperatūrā 50-60 grādi pēc Celsija vienas virknes nukleīnskābju molekulu galiem tiek pievienoti praimeri pēc komplementaritātes veida.
3. Pagarinājums. 72 grādu temperatūrā notiek dezoksiribonukleīnskābes meitas divpavedienu molekulu sintēze.
DNS sekvencēšana
Molekulārās bioloģiskās izpētes metodes bieži vien prasa zināšanas par nukleotīdu secību dezoksiribonukleīnskābes molekulā. Sekvencēšana tiek veikta, lai noteiktu ģenētisko kodu. Nākotnes molekulārā diagnostika tiks balstīta uz zināšanām, kas iegūtas no cilvēka sekvencēšanas.
Izšķir šādus secības veidus:
- Maksima-Gilberta secība;
- Sangera secība;
- pirosekvencēšana;
- nanoporesecība.
