Proteīns ir būtiska visu organismu sastāvdaļa. Katra tā molekula sastāv no vienas vai vairākām polipeptīdu ķēdēm, kas sastāv no aminoskābēm. Lai gan dzīvībai nepieciešamā informācija ir kodēta DNS vai RNS, rekombinantie proteīni organismos veic plašu bioloģisko funkciju klāstu, tostarp fermentatīvo katalīzi, aizsardzību, atbalstu, kustību un regulēšanu. Atbilstoši to funkcijām organismā šīs vielas var iedalīt dažādās kategorijās, piemēram, antivielas, fermenti, strukturālais komponents. Ņemot vērā to svarīgās funkcijas, šādi savienojumi ir intensīvi pētīti un plaši izmantoti.
Agrāk galvenais veids, kā iegūt rekombinanto proteīnu, bija to izolēt no dabiska avota, kas parasti ir neefektīvi un laikietilpīgi. Nesenie bioloģiskās molekulārās tehnoloģijas sasniegumi ir ļāvuši klonēt DNS, kas kodē noteiktu vielu kopu, ekspresijas vektorā tādām vielām kā baktērijas, raugs, kukaiņu šūnas un zīdītāju šūnas.
Vienkārši sakot, rekombinantās olb altumvielas tiek pārvērstas ar eksogēnu DNS produktu palīdzībudzīvās šūnas. To iegūšana parasti ietver divas galvenās darbības:
- Molekulas klonēšana.
- Proteīna izteiksme.
Šobrīd šādas struktūras izgatavošana ir viena no jaudīgākajām metodēm, ko izmanto medicīnā un bioloģijā. Kompozīcijai ir plašs pielietojums pētniecībā un biotehnoloģijā.
Medicīnas virziens
Rekombinantie proteīni nodrošina svarīgu dažādu slimību, piemēram, diabēta, vēža, infekcijas slimību, hemofilijas un anēmijas ārstēšanas līdzekli. Tipiski šādu vielu preparāti ir antivielas, hormoni, interleikīni, fermenti un antikoagulanti. Pieaug vajadzība pēc rekombinantiem preparātiem terapeitiskai lietošanai. Tie ļauj paplašināt ārstēšanas metodes.
ģenētiski modificētiem rekombinantiem proteīniem ir galvenā loma terapeitisko zāļu tirgū. Zīdītāju šūnas pašlaik ražo visvairāk terapeitisko līdzekļu, jo to preparāti spēj ražot augstas kvalitātes dabiskas vielas. Turklāt E. coli tiek ražoti daudzi apstiprināti rekombinantie terapeitiskie proteīni labas ģenētikas, straujas augšanas un augstas produktivitātes dēļ. Tam ir arī pozitīva ietekme uz zāļu izstrādi, kuru pamatā ir šī viela.
Pētniecība
Rekombinanto proteīnu iegūšana balstās uz dažādām metodēm. Vielas palīdz izzināt ķermeņa pamatprincipus un pamatprincipus. Šīs molekulas var izmantot, lai identificētu un noteiktuvielas atrašanās vietu, ko kodē konkrēts gēns, un atklāt citu gēnu funkcijas dažādās šūnu aktivitātēs, piemēram, šūnu signalizācijā, vielmaiņā, augšanā, replikācijā un nāvē, transkripcijā, translācijā un rakstā aplūkoto savienojumu modifikācijās.
Tādējādi novērotais sastāvs bieži tiek izmantots molekulārajā bioloģijā, šūnu bioloģijā, bioķīmijā, struktūras un biofizikālajos pētījumos un daudzās citās zinātnes jomās. Tajā pašā laikā rekombinanto proteīnu iegūšana ir starptautiska prakse.
Šādi savienojumi ir noderīgi instrumenti, lai izprastu starpšūnu mijiedarbību. Tie ir izrādījušies efektīvi vairākās laboratorijas metodēs, piemēram, ELISA un imūnhistoķīmijā (IHC). Rekombinantos proteīnus var izmantot, lai izstrādātu enzīmu testus. Lietojot kopā ar atbilstošām antivielām, šūnas var izmantot kā jauno tehnoloģiju standartus.
Biotehnoloģija
Rekombinantās olb altumvielas, kas satur aminoskābju secību, tiek izmantotas arī rūpniecībā, pārtikas ražošanā, lauksaimniecībā un bioinženierijā. Piemēram, lopkopībā fermentus var pievienot pārtikai, lai palielinātu barības sastāvdaļu uzturvērtību, samazinātu izmaksas un atkritumus, atbalstītu dzīvnieku zarnu veselību, uzlabotu produktivitāti un uzlabotu vidi.
Turklāt pienskābes baktērijas (LAB) uz ilgu laikuir izmantoti, lai ražotu raudzētu pārtiku, un nesen LAB tika izstrādāts rekombinanto proteīnu ekspresijai, kas satur aminoskābju secību, ko var plaši izmantot, piemēram, lai uzlabotu cilvēku, dzīvnieku un uztura gremošanu.
Tomēr šīm vielām ir arī ierobežojumi:
- Dažos gadījumos rekombinanto proteīnu ražošana ir sarežģīta, dārga un laikietilpīga.
- Šūnās ražotās vielas var neatbilst dabiskajām formām. Šī atšķirība var samazināt terapeitisko rekombinanto proteīnu efektivitāti un pat izraisīt blakusparādības. Turklāt šī atšķirība var ietekmēt eksperimentu rezultātus.
- Visu rekombinanto zāļu galvenā problēma ir imunogenitāte. Visiem biotehnoloģiju produktiem var būt kāda veida imunogenitāte. Ir grūti paredzēt jaunu terapeitisko proteīnu drošību.
Kopumā biotehnoloģijas sasniegumi ir palielinājuši un veicinājuši rekombinanto proteīnu ražošanu dažādiem lietojumiem. Lai gan tām joprojām ir daži trūkumi, tās ir svarīgas medicīnā, pētniecībā un biotehnoloģijā.
Slimības saite
rekombinantais proteīns nav kaitīgs cilvēkiem. Tā ir tikai neatņemama kopējās molekulas sastāvdaļa konkrētas zāles vai uztura elementa izstrādē. Daudzi medicīniskie pētījumi ir parādījuši, ka FGFBP3 proteīna (saīsināti BP3) piespiedu ekspresija aptaukošanās peļu laboratorijas celmā uzrādīja ievērojamu ķermeņa tauku samazināšanos.masu, neskatoties uz ģenētisko noslieci lietot.
Šo izmēģinājumu rezultāti liecina, ka FGFBP3 proteīns var piedāvāt jaunu terapiju tādiem traucējumiem, kas saistīti ar vielmaiņas sindromu, piemēram, 2. tipa cukura diabētu un taukainu aknu slimību. Bet, tā kā BP3 ir dabisks proteīns, nevis mākslīgs medikaments, rekombinantā cilvēka BP3 klīniskie pētījumi varētu sākties pēc pēdējās preklīnisko pētījumu kārtas. Tas ir, ir iemesli, kas saistīti ar šādu pētījumu veikšanas drošību. Rekombinantais proteīns nav kaitīgs cilvēkiem, jo tas tiek pakāpeniski apstrādāts un attīrīts. Izmaiņas notiek arī molekulārā līmenī.
PD-L2, viens no galvenajiem spēlētājiem imūnterapijas jomā, tika nominēts 2018. gada Nobela prēmijai fizioloģijā vai medicīnā. Šis darbs, ko uzsāka profesors Džeimss P. Elisons no ASV un profesors Tasuku Honjo no Japānas, ir novedis pie vēža, piemēram, melanomas, plaušu vēža un citu slimību ārstēšanas, pamatojoties uz kontrolpunktu imūnterapiju. Nesen AMSBIO savai imūnterapijas līnijai ir pievienojis nozīmīgu jaunu produktu - PD-L2/TCR aktivatoru - CHO Recombinant Cell Line.
Jēdzienu pierādīšanas eksperimentos pētnieki no Alabamas universitātes Birmingemā, kuru vadīja H. Longs Džens, MD, profesors Roberts B. Adamss un laboratorijas medicīnas direktors, Patoloģijas departaments, UAB School of Medicīna, ir izcēluši iespējamu terapiju retam, bet letālam asiņošanas traucējumam, TTP.
Šī rezultātipētījumi pirmo reizi parāda, ka ar rADAMTS13 ielādētu trombocītu pārliešana var būt jauna un potenciāli efektīva terapeitiska pieeja artēriju trombozei, kas saistīta ar iedzimtu un imūnsistēmas izraisītu TTP.
Rekombinantā olb altumviela ir ne tikai uzturviela, bet arī zāles izstrādājamā medikamenta sastāvā. Šīs ir tikai dažas jomas, kas tagad ir saistītas ar medicīnu un ir saistītas ar visu tās strukturālo elementu izpēti. Kā liecina starptautiskā prakse, vielas struktūra ļauj molekulārā līmenī risināt daudzas nopietnas problēmas cilvēka organismā.
Vakcīnas izstrāde
Rekombinantais proteīns ir specifisks molekulu kopums, ko var modelēt. Līdzīga īpašība tiek izmantota arī vakcīnu izstrādē. Jauna vakcinācijas stratēģija, kas pazīstama arī kā īpašas rekombinantā vīrusa injekcijas izmantošana, varētu pasargāt miljoniem vistu, kurām ir risks no nopietnas elpceļu slimības, paziņoja Edinburgas Universitātes un Pirbraitas institūta pētnieki. Šīs vakcīnas izmanto nekaitīgas vai vājas vīrusa vai baktērijas versijas, lai organisma šūnās ievadītu baktērijas. Šajā gadījumā eksperti izmantoja rekombinantos vīrusus ar dažādiem smailes proteīniem kā vakcīnas, lai izveidotu divas nekaitīga vīrusa versijas. Šim savienojumam ir izveidots daudz dažādu narkotiku.
Rekombinanto proteīnu tirdzniecības nosaukumi un analogi ir šādi:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Tās galvenokārt ir pretvēža zāles, taču ir arī citas ārstēšanas jomas, kas saistītas ar šo aktīvo vielu.
Jauna vakcīna, saukta arī par LASSARAB, kas paredzēta cilvēku aizsardzībai gan pret Lasas drudzi, gan trakumsērgu, ir uzrādījusi daudzsološus rezultātus preklīniskajos pētījumos, liecina jauns pētījums, kas publicēts zinātniskajā žurnālā Nature Communications. Inaktivētās rekombinantās vakcīnas kandidāts izmanto novājinātu trakumsērgas vīrusu.
Pētnieku grupa ievietoja Lassa vīrusa ģenētisko materiālu trakumsērgas vīrusa vektorā, lai vakcīna ekspresētu virsmas proteīnus gan Lassa, gan trakumsērgas šūnās. Šie virsmas savienojumi izraisa imūnreakciju pret infekcijas izraisītājiem. Pēc tam šī vakcīna tika inaktivēta, lai "iznīcinātu" dzīvo trakumsērgas vīrusu, ko izmantoja nesēja iegūšanai.
Metožu iegūšana
Ir vairākas sistēmas vielas iegūšanai. Vispārējā metode rekombinantā proteīna iegūšanai ir balstīta uz bioloģiskā materiāla iegūšanu no sintēzes. Bet ir arī citi veidi.
Šobrīd ir piecas galvenās izteiksmes sistēmas:
- E. coli ekspresijas sistēma.
- Rauga izteiksmes sistēma.
- Kukaiņu šūnu ekspresijas sistēma.
- Zīdītāju šūnu ekspresijas sistēma.
- Bezšūnu proteīnu ekspresijas sistēma.
Pēdējais variants ir īpaši piemērots transmembrānu proteīnu ekspresijaiun toksiskie savienojumi. Pēdējos gados vielas, kuras ir grūti ekspresēt ar tradicionālajām intracelulārām metodēm, ir veiksmīgi integrētas šūnās in vitro. B altkrievijā plaši izmanto rekombinanto proteīnu ražošanu. Ar šo problēmu nodarbojas vairāki valsts uzņēmumi.
Cell Free Protein Synthesis System ir ātra un efektīva metode mērķa vielu sintezēšanai, pievienojot dažādus substrātus un enerģijas savienojumus, kas nepieciešami transkripcijai un translācijai šūnu ekstraktu enzīmu sistēmā. Pēdējos gados pakāpeniski ir parādījušās bezšūnu metožu priekšrocības tādām vielām kā sarežģītas, toksiskas membrānas, parādot to iespējamo pielietojumu biofarmācijas jomā.
Tehnoloģija bez šūnām var viegli un kontrolētā veidā pievienot dažādas dabā neesošas aminoskābes, lai panāktu sarežģītus modifikācijas procesus, kurus ir grūti atrisināt pēc parastās rekombinantās ekspresijas. Šādām metodēm ir augsta pielietojuma vērtība un potenciāls zāļu piegādei un vakcīnu izstrādei, izmantojot vīrusiem līdzīgas daļiņas. Brīvās šūnās ir veiksmīgi ekspresēts liels skaits membrānas proteīnu.
Skaņdarbu izteiksme
Rekombinantais proteīns CFP10-ESAT 6 tiek ražots un izmantots vakcīnu radīšanai. Šāds tuberkulozes alergēns ļauj stiprināt imūnsistēmu un izstrādāt antivielas. Kopumā molekulārie pētījumi ietver jebkura proteīna aspekta, piemēram, struktūras, funkcijas, modifikāciju, lokalizācijas vai mijiedarbības, izpēti. Izpētītkā konkrētas vielas regulē iekšējos procesus, pētniekiem parasti ir nepieciešami līdzekļi, lai radītu interesējošos un labvēlīgos funkcionālos savienojumus.
Ņemot vērā proteīnu lielumu un sarežģītību, ķīmiskā sintēze nav dzīvotspējīga iespēja šiem centieniem. Tā vietā dzīvās šūnas un to šūnu iekārtas parasti tiek izmantotas kā rūpnīcas, lai radītu un konstruētu vielas, pamatojoties uz sniegtajām ģenētiskajām veidnēm. Pēc tam rekombinantā proteīna ekspresijas sistēma ģenerē nepieciešamo struktūru, lai izveidotu zāles. Tālāk seko nepieciešamo materiālu atlase dažādām narkotiku kategorijām.
Atšķirībā no olb altumvielām, DNS ir viegli konstruēt sintētiski vai in vitro, izmantojot vispāratzītas rekombinantās metodes. Tāpēc specifisku gēnu DNS veidnes ar vai bez pievienotām reportiera sekvencēm vai afinitātes marķējuma sekvencēm var izveidot kā veidnes uzraudzītās vielas ekspresijai. Šādus savienojumus, kas iegūti no šādām DNS veidnēm, sauc par rekombinantiem proteīniem.
Tradicionālās vielas ekspresijas stratēģijas ietver šūnu transfekciju ar DNS vektoru, kas satur veidni, un pēc tam šūnu kultivēšanu, lai transkribētu un tulkotu vēlamo proteīnu. Parasti šūnas pēc tam tiek lizētas, lai ekstrahētu izteikto savienojumu turpmākai attīrīšanai. Rekombinantais proteīns CFP10-ESAT6 tiek apstrādāts šādā veidā un iziet cauri attīrīšanas sistēmai no iespējamāstoksīnu veidošanos. Tikai pēc tam tas tiks sintezēts par vakcīnu.
Plaši tiek izmantotas gan prokariotu, gan eikariotu molekulāro vielu ekspresijas sistēmas in vivo. Sistēmas izvēle ir atkarīga no proteīna veida, funkcionālās aktivitātes prasībām un vēlamās ražas. Šīs ekspresijas sistēmas ietver zīdītājus, kukaiņus, raugus, baktērijas, aļģes un šūnas. Katrai sistēmai ir savas priekšrocības un izaicinājumi, un pareizas sistēmas izvēle konkrētam lietojumam ir svarīga, lai veiksmīgi izpaustos pārskatāmā viela.
Izteiksme no zīdītājiem
Rekombinanto proteīnu izmantošana ļauj izstrādāt dažāda līmeņa vakcīnas un zāles. Šim nolūkam var izmantot šo vielas iegūšanas metodi. Zīdītāju ekspresijas sistēmas var izmantot, lai ražotu proteīnus no dzīvnieku valsts, kam ir visdabiskākā struktūra un aktivitāte to fizioloģiski atbilstošās vides dēļ. Tas rada augstu pēctranslācijas apstrādes un funkcionālās aktivitātes līmeni. Zīdītāju ekspresijas sistēmas var izmantot, lai ražotu antivielas, kompleksus proteīnus un savienojumus izmantošanai šūnu funkcionālajos testos. Tomēr šīs priekšrocības ir saistītas ar stingrākiem audzēšanas nosacījumiem.
Zīdītāju ekspresijas sistēmas var izmantot, lai īslaicīgi vai caur stabilām šūnu līnijām ģenerētu proteīnus, kur ekspresijas konstrukcija ir integrēta saimnieka genomā. Lai gan šādas sistēmas var izmantot vairākos eksperimentos, laiksražošana var radīt lielu daudzumu vielas vienas līdz divu nedēļu laikā. Šāda veida rekombinanto proteīnu biotehnoloģija ir ļoti pieprasīta.
Šajās īslaicīgās, augstas ražības zīdītāju ekspresijas sistēmās tiek izmantotas suspensijas kultūras, un tās var iegūt gramus uz litru. Turklāt, salīdzinot ar citām ekspresijas sistēmām, šiem proteīniem ir vairāk vietējo locīšanas un pēctranslācijas modifikāciju, piemēram, glikozilācijas.
Kukaiņu izteiksme
Rekombinanto proteīnu ražošanas metodes attiecas ne tikai uz zīdītājiem. Ir arī produktīvāki veidi ražošanas izmaksu ziņā, lai gan vielas iznākums uz 1 litru apstrādātā šķidruma ir daudz mazāks.
Kukaiņu šūnas var izmantot, lai ekspresētu augsta līmeņa proteīnu ar modifikācijām, kas līdzīgas zīdītāju sistēmām. Ir vairākas sistēmas, ko var izmantot, lai radītu rekombinanto bakulovīrusu, ko pēc tam var izmantot interesējošās vielas ekstrahēšanai kukaiņu šūnās.
Rekombinanto proteīnu ekspresijas var viegli palielināt un pielāgot augsta blīvuma suspensijas kultūrai liela mēroga molekulu savienošanai. Funkcionāli tie ir vairāk līdzīgi zīdītāju vielas dabiskajam sastāvam. Lai gan raža var būt līdz 500 mg/l, rekombinantā bakulovīrusa ražošana var būt laikietilpīga un kultivēšanas apstākļi ir grūtāki nekā prokariotu sistēmām. Tomēr dienvidu un siltākās zemēs līdzīgsmetode tiek uzskatīta par efektīvāku.
Baktēriju izpausme
Rekombinanto proteīnu ražošanu var izveidot ar baktēriju palīdzību. Šī tehnoloģija ievērojami atšķiras no iepriekš aprakstītajām. Baktēriju proteīnu ekspresijas sistēmas ir populāras, jo baktērijas ir viegli kultivētas, tās ātri aug un nodrošina augstu rekombinantā preparāta ražu. Tomēr daudzdomēnu eikariotu vielas, kas izteiktas baktērijās, bieži vien ir nefunkcionālas, jo šūnas nav aprīkotas, lai veiktu nepieciešamās pēctranslācijas modifikācijas vai molekulāro locīšanu.
Turklāt daudzi proteīni kļūst nešķīstoši kā ieslēguma molekulas, kuras ir ļoti grūti atgūt bez skarbiem denaturatoriem un sekojošām apgrūtinošām molekulārās pārlocīšanas procedūrām. Šī metode lielākoties tiek uzskatīta par lielākoties eksperimentālu.
Šūnu brīva izteiksme
Rekombinanto proteīnu, kas satur stafilokināzes aminoskābju secību, iegūst nedaudz savādāk. Tas ir iekļauts daudzu veidu injekcijās, pirms lietošanas ir nepieciešamas vairākas sistēmas.
Proteīnu ekspresija bez šūnām ir vielas sintēze in vitro, izmantojot translācijas ziņā saderīgus veselu šūnu ekstraktus. Principā veselu šūnu ekstrakti satur visas makromolekulas un komponentus, kas nepieciešami transkripcijai, translācijai un pat pēctranslācijas modifikācijām.
Šie komponenti ietver RNS polimerāzi, regulējošos proteīnu faktorus, transkripcijas formas, ribosomas un tRNS. Pievienojotkofaktori, nukleotīdi un īpaša gēna veidne, šie ekstrakti var sintezēt interesējošos proteīnus dažu stundu laikā.
Lai gan tās nav ilgtspējīgas liela mēroga ražošanai, bezšūnu vai in vitro proteīnu ekspresijas (IVT) sistēmas piedāvā vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar tradicionālajām in vivo sistēmām.
Izpausme bez šūnām nodrošina ātru rekombinanto preparātu sintēzi, neiesaistot šūnu kultūru. Bezšūnu sistēmas ļauj marķēt olb altumvielas ar modificētām aminoskābēm, kā arī ekspresēt savienojumus, kas ātri proteolītiski sadalās ar intracelulāro proteāžu palīdzību. Turklāt ir vieglāk vienlaikus ekspresēt daudz dažādu proteīnu, izmantojot bezšūnu metodi (piemēram, pārbaudot proteīnu mutācijas ar neliela mēroga ekspresiju no daudzām dažādām rekombinantās DNS veidnēm). Šajā reprezentatīvajā eksperimentā cilvēka kaspāzes-3 proteīna ekspresijai tika izmantota IVT sistēma.
Secinājumi un nākotnes perspektīvas
Rekombinanto proteīnu ražošanu tagad var uzskatīt par nobriedušu disciplīnu. Tas ir daudzu pakāpenisku attīrīšanas un analīzes uzlabojumu rezultāts. Pašlaik zāļu atklāšanas programmas reti tiek pārtrauktas, jo nespēj ražot mērķa proteīnu. Paralēli procesi vairāku rekombinanto vielu ekspresijai, attīrīšanai un analīzei tagad ir labi zināmi daudzās laboratorijās visā pasaulē.
Olb altumvielu kompleksi un augoši panākumi veidošanāizšķīdinātām membrānu struktūrām būs nepieciešamas vairāk izmaiņu, lai neatpaliktu no pieprasījuma. Efektīvu līgumpētniecības organizāciju rašanās regulārākai olb altumvielu piegādei ļaus pārdalīt zinātniskos resursus, lai risinātu šīs jaunās problēmas.
Turklāt paralēlām darbplūsmām būtu jāļauj izveidot pilnīgas uzraugāmās vielas bibliotēkas, lai nodrošinātu jaunu mērķa identificēšanu un uzlabotu skrīningu, kā arī tradicionālos mazu molekulu zāļu atklāšanas projektus.
